摘要[目的]比较不同的碳源、氮源、无机盐对斯鲁菲亚海洋红酵母（Rhodotorula slooffiae）菌株产量的影响，确定培养基最优组分。[方法]通过葡萄糖、酵母浸粉、硫酸铵、磷酸二氢钾4因素3水平的正交试验，确定斯鲁菲亚海洋红酵母的最优培养基。[结果]斯鲁菲亚海洋红酵母的最优培养基各成分质量分数为：葡萄糖2%，酵母浸粉0.75%，硫酸铵0.5%，磷酸二氢钾1%。接种量6%，500 mL三角锥形瓶，装液量100 mL，培养温度30 ℃，经过48 h培养，菌种量最大可达8.6×108 CFU/mL，比优化前的发酵培养基产量（6.6×108 CFU/mL）提升了30%。[结论]培养条件和工艺的优化可以显著提高海洋红酵母菌量和类胡萝卜素含量。
关键词海洋红酵母；发酵；培养条件优化
中图分类号S917.1文献标识码A文章编号0517-6611（2018）28-0001-03
Fermentation Conditions Optimization of Rhodotorula slooffiae
ZHANG Chuan，XU Zhijin，LIU Minhai et al
（Zhoushan Fisheries Research Institute of Zhejiang Province， Zhoushan，Zhejiang 316000）
Abstract[Objective]The effects of different carbon sources， nitrogen sources and inorganic salts on fermentation yield of marine red yeast（Rhodotorula slooffiae） were compared to determine the optimal medium components. [Method]The optimum fermentation conditions for Rhodotorula slooffiae were determined by 4 factors and 3 levels orthogonal test.[Result]The optimum fermentation conditions for Rhodotorula slooffiae were determined： glucose 2%， yeast extract powder 0.75%， ammonium sulfate 0.5%， monopotassium phosphate 1%， and inoculation amount 6%， temperature 30 ℃， 100 mL medium in 500 mL triangle bottle and fermentation time 48 h. Under above conditions， the cell biomass of marine red yeast can reach 8.6×108 cfu/mL， which increased by 30% as compared with the fermentation before optimization. [Conclusion]Optimization of culture conditions and process can significantly increase the amount of marine red yeast and carotenoid content.
Key wordsMarine red yeast；Fermentation；Conditions optimization
海洋红酵母（Rhodotorula slooffiae）是存在于海水中的一种单细胞酵母品系，大部分分布在海水和海底沉积物中，通过合成各种酶和代谢产物，可以在极端环境下生存；也有一些种类寄附在鱼虾和贝类上，互利共生[1-2]。海洋红酵母富含丰富的蛋白质、必需氨基酸、天然色素、维生素等生物活性物质，具有较高的营养价值，此外还可以使水产动物色泽亮丽，肉质鲜美，常被作为水产动物育苗的开口饵料[3-4]。海洋红酵母中含有的葡聚糖和甘露糖蛋白等成分，使其能刺激宿主的免疫和抗氧化系统，提高抗氧化、生物免疫力和抗基因毒性等功能[5]。养殖饲料中添加海洋红酵母可以有效提高水产动物幼苗的存活率和抗病能力，还可以提高虾青素在动物体内的积累，增强动物免疫力和恶劣环境耐受力[6]。
在生态环境修复方面，海洋红酵母可以将烃类化合物降解为小分子物质，吸收重金属离子，处理海洋污染。水体酸化方面应用广泛。海洋红酵母能够促进肠道中益生菌的生长繁殖，起到调整肠胃的发酵过程以及pH，有助于肠胃平时的消化吸收活动，其作为食品添加剂已经被广泛应用于食品加工中[7]。
近年来，关于海洋红酵母的研究逐渐增加，主要集中在菌种的选育、代谢产物的测定、发酵工艺优化和促进类胡萝卜素合成等方面。优化海洋红酵母的发酵工艺具有重要的生态价值和经济价值。该研究从选择最佳碳源、氮源和无机盐及最适质量分数入手，优化斯鲁菲亚海洋红酵母培养基，提高产率降低成本，旨在为该菌株的下一步工业化发酵罐生产提供理论依据和参考。
1材料与方法
1.1菌种
1.1.1菌种来源。
海洋红酵母，由辽东学院提供，菌株培养采用YPD培养基。
1.1.2培养基。
YPD培养基：葡萄糖2.0%，蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，瓊脂2.0%，陈海水100 mL，自然pH。种子培养基：葡萄糖1.0%，硫酸铵1.0%，酵母浸粉1%，磷酸二氢钾1%，陈海水100 mL，自然pH。
1.1.3菌株培养 。
斜面活化。保存于冰箱中的菌种接种到斜面培养基上活化，30 ℃培养48 h。
1.1.4摇床扩陪。从斜面培养基上接种到500 mL三角锥形瓶中，装液量为80 mL，30 ℃，160 r/min，培养24 h形成种子培养基。再将种子培养基以6%的接种量，接入装量100 mL的500 mL 锥形瓶发酵培养基中，摇床转速设为180 r/min。
1.1.5酵母菌的生理生化鉴定。
参照《微生物学实验手册》[8]和《酵母菌的特征与鉴定手册》[9]对海洋红酵母进行糖源发酵、碳源同化、氮源同化等生理生化试验。
1.2培养基发酵条件优化试验
1.2.1单因素试验。
以种子培养基为基准培养基，调节各培养基要素，其中，
碳源试验：以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉为碳源，含量为同一质量分数（1%～2%），培养条件：温度30 ℃、盐度28.5‰、pH 8.2；培养容器为三角锥形瓶；培养时间为48 h。
氮源试验：分别以硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母浸粉为氮源，含量设置为同一质量分数1%；培养条件：温度30 ℃、盐度28.5‰、pH 8.2；培养容器：三角锥形瓶；培养时间4 8 h。
无机盐试验：以磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙为其他无机成分，含量为同一质量分数（1%～2%），培养条件：温度30 ℃、盐度28.5‰、pH 8.2；培养容器：三角锥形瓶；培养时间48 h。
以海洋红酵母生物量为参考指标，挑选适宜的碳源、氮源和无机盐以及培养基用量。
1.2.2正交试验。
根据单因素试验结果，选择葡萄糖、酵母浸粉、硫酸铵、磷酸二氢钾4个因素，各取3个水平（表1），共设有9个组，每组有3个平行对照，取各数据平均值，筛选出最优组合。
1.3细胞生物量测定
采用血球板计数法，将取出的发酵液稀释100倍，用胶头滴管吸取后滴到血球计数板上，用盖玻片盖好，放于显微镜40倍镜下观察并找到网格，换100倍镜计数[8]。
1.4类胡萝卜素提取与测定
采用丙酮法萃取得到类胡萝卜素提取液，使用分光光度计在475 nm处测定吸光度，根据公式计算：色素含量（μg/g干菌体）=Amax×D×V/0.16W，式中，A为475 nm波长处的吸光度，V为丙酮的用量（mL），D为测定试样时的稀释倍数，W为酵母菌干重（g），0.16为胡萝卜素的摩尔消光系数[10]。
2结果与分析
2.1酵母菌生长曲线
發酵培养后，从0 h开始，每隔6 h取样一次，进行菌数测定，记录数据，并绘制该菌株生长曲线，如图1所示。从图1可以看出，在接种6 h之后，菌体即快速生长，6～36 h菌株进入对数期快速增长，菌的数量达到最高6.6×108 CFU/mL，36 h后菌数下降，之后逐渐进入衰亡期。
2.2单因素试验结果
2.2.1最佳碳源和质量分数。
用4种不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉）作比较试验，其质量分数相同（1%），在其他成分相同的情况下，斯鲁菲亚红酵母对4种碳源都能够同化，其中对葡萄糖利用效果最好（表2）。以葡萄糖为碳源的培养基中，酵母菌的生物量达到5.6×108 CFU/mL；而使用淀粉作为碳源效果最差，酶母菌的生物量只有3.7×108 CFU/mL。麦芽糖在提高菌体中类胡萝卜素含量方面效果最好，葡萄糖次之，蔗糖最差。
以葡萄糖作为碳源，选择不同质量分数的葡萄糖进行试验，结果如图2所示。在葡萄糖质量分数为1%～2%时，随着葡萄糖质量分数的增加，菌量也在增大，当葡萄糖浓度达到2%时菌数最高；当葡萄糖浓度大于2%时，菌数逐渐下降，当葡萄糖浓度为5%时，菌数最低只有4.8×108 CFU/mL。综上所述，选择2%葡萄糖作为碳源，海洋红酵母的产量最高，达到6.2×108 CFU/mL，葡萄糖质量分数过高过低都不利于红酵母增殖。
2.2.2最佳氮源的确定。
用4种不同的氮源（蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、酵母浸粉）作比较试验，其质量分数相同（1%），在其他成分相同的情况下，发现含有酵母浸粉的培养基对菌体生长更有利，菌数最高可达5.57×108 CFU/mL（表3）。有机氮源对菌生物量的促进作用高于硫酸铵、氯化铵这些无机氮源；但无机氮源更有益于类胡萝卜素含量的增加[11]。通过无机氮源和有机氮源的科学调配可以实现对海洋红酵母发酵后期效价单位的涨幅调控和生长周期的延长，所以应该在培养基中选择一定量的硫酸铵搭配酵母浸粉使用[12]。
2.2.3最佳无机盐的确定。
用3种无机盐（磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁）作比较试验，其质量分数相同（1%），在其他成分相同的情况下，发现含有磷酸二氢钾的培养基对菌体生长和类胡萝卜素的合成促进作用更明显（表4）。
以磷酸二氢钾为无机盐，检验不同浓度下磷酸二氢钾对海洋红酵母生物量的影响，结果如图3所示。当无机盐质量分数为0.5%～1.0%，酵母菌生物量随着盐浓度升高而增加。无机盐浓度在1.0%～2.0%时，盐浓度抑制酵母菌量的增长，在2.0%～2.5%时生物量又略有上升。总体来说，培养基中磷酸二氢钾的质量分数为1%时，菌数最大为4.72×108 CFU/mL。
2.3正交试验结果
通过单因素试验，确定培养基最优组分。使用SPSS软件对数据进行方差分析和显著性差异分析。从表5可知，4种因素对斯鲁菲亚海洋红酵母菌株发酵菌量影响各不相同，顺序为B>A>D>C。硫酸铵浓度变化对海洋红酵母菌数影响不显著（P>0.05），酵母浸粉浓度的变化对海洋红酵母菌数具有显著性影响（P<0.05），其最适浓度为0.75%。海洋红酵母菌数最优培养条件为A2B3C1D2，即葡萄糖2%，酵母浸粉0.75%，硫酸铵0.5%，磷酸二氢钾1.0%，在此优化条件下海洋红酵母菌量可达8.6×108 CFU/mL，比优化前的发酵培养基（6.6×108 CFU/mL）提升了30%。
3结论与讨论
对斯鲁菲亚海洋红酵母进行培养基优化，对于提高菌的生物量而言葡萄糖效果最好，最佳质量分数为2%；最佳氮源为酵母粉和硫酸铵，最佳质量分数分别为0.75%和0.5%；无机盐中1.0%磷酸二氢钾效果最好。在此培养条件下，海洋红酵母菌量最大可达到8.6×108 CFU/mL，比优化前的发酵培养基（6.6×108 CFU/mL）提升了30%。正交试验中4种因素对斯鲁菲亚海洋红酵母菌株发酵菌量影响各不相同，其中酵母浸粉>葡萄糖>磷酸二氢钾>硫酸铵。需要指出的是配比3%葡萄糖、0.75%酵母浸粉、1%硫酸铵、1%磷酸二氢钾的培养基，红酵母菌量达到8.4×108 CFU/mL，实际生产过程中可以根据原料来源和成本综合考量，选择最优配比。
海洋红酵母是海洋环境中重要的菌种资源，其所含有的丰富营养物质及代谢过程中产生的活性物质，使其具有广泛的市场前景和经济效益。现阶段国内外学者对海洋红酵母的研究大多集中在菌种选育、发酵工艺优化和促进类胡萝卜素合成等方面的研究。而培养基中不同的pH、温度、光照和接种量也会影响红酵母的生物量和类胡萝卜素的产量[13-14]，添加不同金属离子和氨基酸对海洋红酵母发酵生产虾青素具有重要的影响[3]。综上研究可见，不同的培养条件和工艺对海洋红酵母的生长和色素的合成有很大的影响，所以进一步研究优化海洋红酵母的培养条件，能为海洋红酵母的开发应用提供重要的理论基础和实践意义[15]。
参考文献
[1] 赵述淼，韩继宏.浅谈酵母在水产养殖上的应用[J].中国水产，2003（7）：68-69.
[2] 李臣，阮榕生，林向阳，等.红酵母的性质及其应用研究[J].农产品加工，2006（5）：20-22，25.
[3] 刘秀莲，王宇光.海洋红酵母的研究进展[J].生物技术通讯，2008，19（2）：293-295.
[4] 赵昌会，罗静瑶.海洋酵母菌的研究进展[J].湖南科技学院学报，2008，29（8）：59-60.
[5] 张超，刘军.SCP生产菌海洋红酵母摇瓶培养研究[J].四川轻化工学院学报，2010，13（3）：71-74.